Amylase et inhibiteur dissous dans l'éthanol
Un étudiant étudie l'α-amylase salivaire. Il mesure la vitesse initiale de production de maltose (µmol/min) pour quatre concentrations de starch, sans inhibiteur et avec 2,0 mM d'un inhibiteur. L'inhibiteur est préparé dans l'éthanol ; le milieu inhibiteur contient 2 % (v/v) d'éthanol, le contrôle n'en contient pas. Température 37 °C, pH 6,9. Les données sont : [S] = 1,0 ; 2,0 ; 4,0 ; 8,0 mM. v contrôle = 33,3 ; 50,0 ; 66,7 ; 80,0. v inhibiteur = 14,3 ; 25,0 ; 40,0 ; 57,1. Un camarade conclut : « l'inhibiteur est non compétitif car la vitesse baisse ». L'étudiant veut savoir si le protocole permet cette conclusion et comment exploiter correctement les données. Aucun essai avec l'éthanol seul n'a été réalisé.
1. Calculer les inverses et estimer Km et Vmax pour les deux séries. Quel type d'inhibition les données suggèrent-elles ?
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On trace 1/v en fonction de 1/[S]. Contrôle : 1/[S] = 1,00 ; 0,50 ; 0,25 ; 0,125 mM⁻¹ et 1/v = 0,0300 ; 0,0200 ; 0,0150 ; 0,0125 (µmol/min)⁻¹. La droite a pour ordonnée à l'origine environ 0,0100 et pour pente environ 0,020. Donc Vmax ≈ 1/0,0100 = 100 µmol/min et Km = pente × Vmax ≈ 2,0 mM. Inhibiteur : 1/v = 0,0699 ; 0,0400 ; 0,0250 ; 0,0175. L'ordonnée à l'origine reste voisine de 0,0100, donc Vmax ≈ 100 µmol/min, tandis que la pente augmente à environ 0,060, soit Km ≈ 6,0 mM. Même Vmax et Km augmenté : les données suggèrent une inhibition compétitive. L'affirmation « non compétitif car la vitesse baisse » est incorrecte : une baisse de vitesse à une seule concentration ne classe pas l'inhibition.
2. Identifier le défaut de protocole et proposer un contrôle.
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Le milieu inhibiteur contient 2 % d'éthanol, mais le contrôle n'en contient pas. Or l'éthanol peut lui-même modifier l'activité de l'amylase. La comparaison mélange donc deux effets : inhibiteur et véhicule. Il faut ajouter un contrôle véhicule contenant 2 % d'éthanol sans inhibiteur, et comparer inhibiteur + éthanol à éthanol seul. Il faut aussi utiliser le même tampon, le même pH, la même température, le même temps de préincubation et le même lot d'enzyme, et faire des réplicats. Sans ce contrôle, on ne peut pas attribuer la baisse de vitesse à l'inhibiteur.
3. À 1,0 mM et 8,0 mM, calculer le pourcentage d'inhibition et expliquer en quoi ce calcul ne suffit pas.
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À 1,0 mM : inhibition = (33,3 − 14,3)/33,3 = 57,1 %. À 8,0 mM : inhibition = (80,0 − 57,1)/80,0 = 28,6 %. L'effet diminue fortement quand [S] augmente, ce qui est cohérent avec une inhibition compétitive, car le substrat déplace l'inhibiteur. Une inhibition non compétitive donnerait plutôt un pourcentage d'inhibition semblable aux deux concentrations. Cependant, ce calcul ne suffit pas à conclure, car l'éthanol n'est présent que dans la série inhibiteur. Il faut d'abord répéter l'expérience avec un contrôle véhicule à 2 % d'éthanol.