Fermentación y respiración en levaduras: balance de ATP y el efecto de un desacoplante
Un grupo de alumnos cultiva Saccharomyces cerevisiae en un biorreactor con 10 g/L de glucosa como única fuente de carbono. En el ensayo A se mantiene aireación constante (O2 disuelto 8 mg/L); en el ensayo B el reactor se sella y se burbujea nitrógeno. A los 30 minutos, en A se han consumido 2,0 g de glucosa y se recuperan 0,90 g de biomasa seca; en B se consumen también 2,0 g de glucosa y se recuperan 0,98 g de etanol y 0,15 g de biomasa, sin variación apreciable del pH. El etanol se cuantifica por cromatografía de gases y la biomasa por pesada tras secado. En un tercer ensayo C, idéntico a A, se añade 2,4-dinitrofenol: el consumo de O2 se duplica, la temperatura del cultivo sube 0,8 °C y la biomasa cae un 70 %. Datos: Mr(glucosa) = 180; Mr(etanol) = 46.
1. Calcula el rendimiento aproximado en ATP de los ensayos A y B y explica la diferencia con los datos de biomasa.
Read the worked answer
Glucosa consumida en cada ensayo: 2,0 g ÷ 180 g/mol = 0,0111 mol.
Ensayo A (aerobio). La oxidación completa rinde entre 30 y 32 ATP por glucosa según el criterio actual (36-38 en los textos clásicos). Tomando 32: 0,0111 × 32 = 0,355 mol de ATP.
Ensayo B (anaerobio). La fermentación alcohólica rinde solo 2 ATP por glucosa, obtenidos por fosforilación a nivel de sustrato en la glucólisis: 0,0111 × 2 = 0,0222 mol de ATP. La estequiometría predice 2 etanol por glucosa: 0,0222 mol × 46 g/mol = 1,02 g, coherente con los 0,98 g medidos (96 % del teórico).
La diferencia es de unas 16 veces más ATP en aerobiosis. En A el NADH y el FADH2 ceden electrones a la cadena respiratoria, se genera un gradiente de protones y la ATP sintasa produce la mayor parte del ATP, con oxidación total del piruvato a CO2 en el ciclo de Krebs. En B no hay aceptor externo de electrones, la cadena no opera y el piruvato se descarboxila a acetaldehído para reoxidar el NADH a etanol, lo que permite que la glucólisis continúe. Con tan poco ATP disponible, la levadura apenas puede fabricar biomasa: de ahí 0,15 g frente a 0,90 g, el llamado efecto Pasteur.
2. Interpreta el ensayo C: ¿por qué el dinitrofenol duplica el consumo de O2, calienta el cultivo y reduce la biomasa?
Read the worked answer
El 2,4-dinitrofenol es un desacoplante: un transportador de protones que atraviesa la membrana mitocondrial interna y devuelve los H+ a la matriz sin pasar por la ATP sintasa. No inhibe la cadena respiratoria; lo que elimina es el gradiente de protones que acopla la oxidación de NADH con la síntesis de ATP.
Consecuencias, en cadena:
- La ATP sintasa queda sin fuerza protonmotriz y la fosforilación oxidativa se detiene: la célula entra en déficit energético.
- La disminución de ATP y de NADH libera la regulación sobre la glucólisis, el ciclo de Krebs y el transporte de electrones; el consumo de O2 se duplica porque los electrones siguen fluyendo hasta el O2.
- La energía del gradiente no se conserva como ATP y se disipa como calor: la temperatura sube 0,8 °C.
- Sin ATP no hay biosíntesis: la biomasa cae un 70 %.
Conviene distinguirlo de un inhibidor como el cianuro, que bloquea la citocromo oxidasa y haría descender el consumo de O2. Precisamente por este efecto hipertermiante se prohibió el uso del dinitrofenol como fármaco adelgazante.
3. El etanol recuperado (0,98 g) es algo menor que el máximo teórico (1,02 g). Propón dos explicaciones y cómo comprobarlas experimentalmente.
Read the worked answer
Explicaciones plausibles:
- Desvío de carbono a biomasa y a otros productos. No todo el piruvato se convierte en etanol: parte se incorpora a biomasa y parte se excreta como glicerol, acetato o succinato, típicos productos minoritarios de la fermentación de la levadura.
- Pérdidas físicas. El etanol es volátil y parte puede escapar con la corriente de gas del reactor, además de perderse en la toma de muestra o en la manipulación previa a la cromatografía. También cabe un error de calibración del cromatógrafo o una lectura de biomasa con humedad residual.
Comprobaciones posibles:
- Cerrar el sistema con un refrigerante o trampa fría para condensar el etanol arrastrado y pesarlo, y sellar las salidas de gas.
- Analizar el sobrenadante por HPLC para cuantificar glicerol, acetato y glucosa residual, y verificar el balance de masa: glucosa consumida = biomasa + etanol + CO2 + otros productos.
- Repetir con patrón interno y duplicados, y comprobar que no queda glucosa sin consumir a los 30 minutos (si quedara, el límite no sería la estequiometría sino el tiempo o la viabilidad celular).