Diurón, DCPIP y dinitrofenol: dos venenos que parecen lo contrario
En un invernadero de tomate de Araba, con 600 µmol de fotones m⁻² s⁻¹, 400 ppm de CO2 y 25 °C, se registra la evolución de O2 y la fijación de CO2 de una planta intacta. Al añadir DCMU (diurón) al medio de riego, la liberación de O2 cae a cero en menos de un minuto y la fijación neta de CO2 se anula dos minutos después.
En un ensayo paralelo con tilacoides aislados y DCPIP (aceptor artificial de electrones, azul en estado oxidado) se miden 120 µmol de DCPIP reducido por mg de clorofila y hora; con 2 µM de DCMU la cifra baja a 5. Si al medio con DCMU se añade ascorbato junto con DCPIPH2 como donador artificial de electrones para el fotosistema I, la reducción de metilviológeno se recupera hasta el 85 % del valor inicial.
Por último, semillas de trigo en germinación tratadas con 2,4-dinitrofenol (DNP) consumen 34 µL de O2 g⁻¹ min⁻¹ frente a 12 µL en el control, su contenido de ATP cae un 70 % y la radícula no emerge.
1. Interprete el experimento con tilacoides: ¿dónde actúa exactamente el DCMU? Escriba las ecuaciones de la fotólisis del agua y de la reducción del NADP+ y explique por qué la planta deja de fijar CO2 aunque siga iluminada.
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Localización del bloqueo. El DCPIP reducido pasa de 120 a 5 µmol mg⁻¹ h⁻¹, es decir, una inhibición del 96 %: el transporte electrónico desde el agua hacia el aceptor artificial queda cortado. La clave está en la recuperación: al aportar un donador artificial de electrones al fotosistema I, la reducción de metilviológeno vuelve al 85 %. Si el bloqueo estuviera en el fotosistema I o después de él, ningún donador anterior lo rescataría. Por tanto el DCMU actúa antes del fotosistema I, en el fotosistema II: se une al nicho de unión de la plastoquinona QB en la proteína D1 y desplaza a QB, de modo que QA no puede reoxidarse y el centro de reacción queda cerrado.
Ecuaciones. Fotólisis del agua en el complejo Mn4CaO5: 2 H2O → O2 + 4 H+ + 4 e−. Reducción del NADP+ en el estroma por la ferredoxina-NADP reductasa: 2 NADP+ + 4 e− + 2 H+ → 2 NADPH. Sumando: 2 H2O + 2 NADP+ → O2 + 2 NADPH + 2 H+.
Por qué cesa la fijación de CO2. El ciclo de Calvin consume ATP y NADPH (3 ATP y 2 NADPH por CO2 fijado). Sin flujo electrónico no hay bombeo de protones al lumen, no hay gradiente electroquímico y la ATP sintasa no fabrica ATP; tampoco se reduce NADP+. Sin ATP ni poder reductor, la rubisco no puede carboxilar de forma sostenida y la fijación neta se anula. La planta muere aunque reciba luz porque la energía absorbida no puede canalizarse hacia la materia orgánica.
2. Explique el efecto del 2,4-dinitrofenol sobre el consumo de oxígeno y sobre la síntesis de ATP en las semillas, y por qué un tratamiento que hace que la semilla consuma casi el triple de oxígeno impide que germine.
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Qué es el DNP. Es un ácido débil lipófilo que atraviesa la membrana mitocondrial interna en forma protonada y libera el protón en la matriz. Transporta H+ sin pasar por la ATP sintasa: es un desacoplante, no un inhibidor de la cadena respiratoria.
Efecto sobre el consumo de O2. La velocidad del transporte electrónico está limitada por el gradiente de protones (control respiratorio). Al disiparlo, los complejos respiratorios pueden bombear sin oposición y la cadena funciona a máxima velocidad: el consumo de O2 sube de 12 a 34 µL g⁻¹ min⁻¹. La energía libre de la oxidación del NADH y del FADH2 no se conserva en enlaces fosfato, sino que se disipa como calor.
Efecto sobre el ATP. El gradiente ya no puede impulsar la ATP sintasa; la fosforilación oxidativa cae y el contenido de ATP baja un 70 %. La relación P/O se aproxima a cero. El mismo efecto que produce el DNP de forma artificial lo realiza la UCP1 en el tejido adiposo pardo, que es fisiológicamente termogénica.
Por qué no germina. La germinación exige biosíntesis intensa: movilización de reservas, síntesis de enzimas hidrolíticas, expansión celular y división. Todos esos procesos consumen ATP. Consumir más oxígeno no significa producir más energía útil: la semilla respira más y rinde menos, por lo que, con un 30 % del ATP disponible, no alcanza a sostener el crecimiento de la radícula. Un dato que refuerza la interpretación es que el efecto del DNP desaparece si se bloquea la cadena respiratoria con cianuro o si falta sustrato oxidable: el desacoplante necesita flujo electrónico activo.
3. A 35 °C y con DCMU aplicado, la planta de tomate del invernadero muestra daño fotooxidativo en las hojas. Explique el origen de ese daño, por qué el bloqueo del transporte electrónico genera especies reactivas de oxígeno y qué mecanismos de protección existen.
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Origen del daño. Con el DCMU unido a D1, el centro de reacción del fotosistema II absorbe fotones pero no puede ceder los electrones a la plastoquinona. La clorofila P680 excitada no encuentra un aceptor y sufre recombinación de carga, pasando a su estado de triplete (3P680). El triplete cede energía al oxígeno molecular, que tiene un estado fundamental de triplete, y genera oxígeno singlete (1O2), una especie muy oxidante. El 1O2 oxida los residuos cercanos, en particular la propia proteína D1, y desencadena la fotoinhibición.
A esto se añade, a 35 °C, que la rubisco aumenta su actividad de oxigenasa y la fijación neta de CO2 baja: el ciclo de Calvin consume menos NADPH y menos ATP, la cadena queda aún más reducida y la producción de especies reactivas crece. Es la misma lógica de fondo del estallido respiratorio del neutrófilo, pero aquí las especies reactivas dañan a la propia célula.
Defensas. La planta disipa el exceso de energía de forma no fotoquímica (ciclo de las xantófilas y proteína PsbS), activa la fotorrespiración y el ciclo de la glutatión-ascorbato, y posee la superóxido dismutasa y la catalasa para eliminar peróxido. Además, la proteína D1 dañada se degrada y se resintetiza continuamente (fotoprotección por recambio). A 35 °C, la síntesis de nuevas D1 es más lenta de lo que es la velocidad de daño, por lo que el balance se inclina hacia la lesión. En el invernadero, la sombra parcial y el enriquecimiento en CO2 reducen la entrada de energía y de sustrato oxidante al mismo tiempo.