Entkoppelte Atmung: DNP und Oligomycin an isolierten Mitochondrien
Im Praktikum werden Mitochondrien aus Rinderleber isoliert und in einem Atmungsmedium mit Phosphatpuffer, MgCl2 und einem Substrat inkubiert. Die Sauerstoffkonzentration wird mit einer Clark-Elektrode kontinuierlich registriert, die ATP-Bildung über die Lumineszenz des Luciferin-Luciferase-Systems. Zunächst wird Glutamat/Malat als Substrat zugegeben; nach Zugabe von ADP steigt die O2-Aufnahme von 8 auf 34 nmol O2 pro Minute und mg Protein, die ATP-Bildung setzt ein. Nach Verbrauch des ADP fällt die Rate auf 8,5 zurück (Respiratorischer Kontrollindex RCI = 4,0). Mit Succinat als Substrat ergibt sich ein RCI von nur 1,8. Anschließend werden zwei Ansätze parallel geführt: Ansatz A erhält 2,4-Dinitrophenol (DNP), Ansatz B erhält Oligomycin. In Ansatz A steigt die O2-Aufnahme auf 33, die ATP-Bildung sinkt unter die Nachweisgrenze; in Ansatz B fällt die O2-Aufnahme auf 6, die ATP-Bildung erlischt ebenfalls. Eine Studentin behauptet, DNP wirke als Atmungsgift, weil es die ATP-Bildung blockiert, und schlägt vor, den Versuch mit Succinat zu wiederholen, um den Effekt deutlicher zu zeigen.
1. Erklären Sie die Beobachtungen in Ansatz A und in Ansatz B mit dem chemiosmotischen Modell. Begründen Sie, warum die Aussage der Studentin, DNP sei ein Atmungsgift, mit den Daten nicht vereinbar ist.
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Ansatz A – DNP entkoppelt: Nach dem chemiosmotischen Modell pumpen die Komplexe I, III und IV Protonen aus der Matrix in den Intermembranraum und bauen ein elektrochemisches Protonenpotential (pmf) auf. DNP ist ein lipophiler Protonenträger und transportiert H+ unter Umgehung der ATP-Synthase zurück in die Matrix. Damit fehlt die treibende Kraft für die Phosphorylierung: ATP fällt unter die Nachweisgrenze. Gleichzeitig entfällt der Gegendruck des pmf auf die Elektronentransportkette, die Kette läuft ungebremst, die O2-Aufnahme bleibt mit 33 nmol/min·mg nahezu auf dem Niveau der ADP-stimulierten Atmung (34). Die Energie wird als Wärme frei.
Ansatz B – Oligomycin hemmt: Oligomycin blockiert den F0-Protonenkanal der ATP-Synthase. Das pmf kann nicht abgebaut werden, der Gegendruck bremst die Elektronentransportkette, die O2-Aufnahme sinkt auf 6. ATP entsteht ebenfalls nicht.
Beide Ansätze zeigen keinen ATP-Nachweis – die Mechanismen sind aber entgegengesetzt: A entkoppelt (hohe O2-Aufnahme, keine ATP-Bildung), B hemmt die ATP-Synthase (niedrige O2-Aufnahme, keine ATP-Bildung).
Gift-Argument: Ein Atmungsgift im engeren Sinn blockiert die Elektronentransportkette (Cyanid an Komplex IV, Rotenon an Komplex I) und senkt die O2-Aufnahme. Hier ist die O2-Aufnahme jedoch maximal. Die Studentin verwechselt »keine ATP-Bildung« mit »keine Atmung«. Ein zusätzlicher Ansatz DNP plus Oligomycin würde das entscheiden: Bleibt die O2-Aufnahme trotz blockierter ATP-Synthase hoch, ist die Entkopplung belegt und eine unspezifische Membranschädigung unwahrscheinlich.
2. Erklären Sie den unterschiedlichen Respiratorischen Kontrollindex von Glutamat/Malat und Succinat. Beurteilen Sie anschließend den Vorschlag der Studentin, den DNP-Versuch mit Succinat zu wiederholen.
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RCI als Kopplungsmaß: Der RCI ist das Verhältnis von ADP-stimulierter Atmung (Zustand 3) zu ADP-limitierter Atmung (Zustand 4). Er zeigt, wie gut Atmung und Phosphorylierung gekoppelt sind, und ist damit ein Qualitätsmerkmal der Präparation.
Substratabhängigkeit: Glutamat und Malat liefern über Komplex I NADH; die Elektronen durchlaufen alle drei Protonenpumpen (I, III, IV). Succinat liefert FADH2 über Komplex II und speist nur die Komplexe III und IV. Der P/O-Quotient und die maximal erreichbare Atmungsrate sind daher niedriger, und der RCI fällt mit 1,8 erwartungsgemäß kleiner aus als 4,0 – ein Zeichen normaler Substratphysiologie, nicht einer Schädigung. Ein RCI nahe 1,0 wäre dagegen ein Hinweis auf entkoppelte oder geschädigte Mitochondrien.
Beurteilung des Vorschlags: Der Vorschlag ist nicht sinnvoll. Erstens ist die DNP-Wirkung substratunabhängig: Jedes Substrat, das ein pmf aufbaut, wird entkoppelt. Zweitens wäre der Effekt nicht »deutlicher«, sondern schlechter auflösbar, weil Ausgangsatmung und RCI niedriger liegen. Drittens würde ein methodisch besseres Vorgehen den Effekt klarer zeigen: DNP im Zustand 4 zugeben und den sprunghaften Anstieg der O2-Aufnahme dokumentieren, parallele Messung des Membranpotentials mit einem Fluoreszenzfarbstoff (Abfall des pmf) sowie der Kombinationsansatz DNP plus Oligomycin. Damit wird die Entkopplung direkt nachgewiesen statt indirekt über den RCI.