Bloqueo del ciclo celular por un inhibidor de la tubulina
Se estudia una línea celular de adenocarcinoma colorrectal. El análisis de contenido de ADN por citometría de flujo (yoduro de propidio) da, en el control: 55 % en G1, 15 % en fase S y 30 % en G2/M. Al añadir el fármaco A (un inhibidor de la polimerización de la tubulina) se obtiene, a las 12 h: 8 % G1, 12 % S y 80 % G2/M; a las 24 h: 25 % sub-G1, 12 % G1, 8 % S y 55 % G2/M. Si el fármaco se retira a las 12 h, a las 48 h el 60 % de las células vuelve a ciclar y el 30 % entra en apoptosis. El tiempo de duplicación de la línea control es de 26 h.
1. ¿En qué fase se acumulan las células? ¿Puede la citometría de contenido de ADN distinguir una parada en G2 de una parada en mitosis? Justifica y propón cómo resolverlo.
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Las células se acumulan con contenido 4n de ADN (80 % en la ventana G2/M a las 12 h), lo que indica un bloqueo antes de la división. El fármaco impide la polimerización de los microtúbulos y, por tanto, la formación del huso mitótico; el punto de control de ensamblaje del huso impide la transición metafase-anafase y las células quedan detenidas en mitosis.
La citometría de contenido de ADN no distingue G2 de mitosis: ambas tienen 4n. Para resolverlo hay que usar marcadores de mitosis, como la fosfohistona H3 fosforilada en Ser10 o la ciclina B1, o bien observar los cromosomas por microscopía (cromosomas condensados, huso alterado). Sin estos datos no se puede afirmar si el bloqueo es en G2 o en mitosis.
2. Interpreta el experimento de lavado y clasifica el fármaco como citostático o citotóxico.
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Tras retirar el fármaco, el 60 % de las células reanuda el ciclo, lo que demuestra que el bloqueo es reversible y que el fármaco es principalmente citostático. Sin embargo, el 30 % muere por apoptosis, de modo que también tiene un componente citotóxico, sobre todo cuando el bloqueo se prolonga.
El 25 % de células sub-G1 a las 24 h indica fragmentación del ADN (células apoptóticas con contenido inferior a 2n). La caída de la ventana G2/M del 80 % al 55 % entre las 12 y las 24 h sugiere que parte de las células detenidas sale de mitosis sin dividirse (slippage mitótico) o muere. En conjunto, el fármaco es citostático reversible a corto plazo y citotóxico si la detención se mantiene, un comportamiento dependiente del tiempo de exposición.
3. Se propone combinar A con un inhibidor del punto de control de ensamblaje del huso. Formula una hipótesis y predice el resultado.
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Hipótesis: si la acumulación en mitosis depende del punto de control de ensamblaje del huso, inhibirlo con un fármaco dirigido a una quinasa de ese punto de control (por ejemplo, Mps1) forzará a las células a salir de mitosis sin completar la división. Se espera una reducción del pico 4n y un aumento de la muerte celular por catástrofe mitótica, con aparición de células aneuploides.
Predicción: la combinación debería disminuir la fracción G2/M y aumentar la sub-G1 respecto a A solo, con menor supervivencia clonogénica. Riesgo: algunas células pueden sobrevivir como aneuploides y generar resistencia. El experimento debe incluir A solo, inhibidor solo, vehículo y una línea no tumoral como control de selectividad, y medir viabilidad, apoptosis y clonogenicidad, no solo el contenido de ADN.