Cékla-pigmentkiáramlás: membránkárosodás hőmérséklet és detergens hatására
Egy gyakorlaton 5 mm átmérőjű, 2 cm hosszú céklaszeleteket mostak, majd 20 percig különböző hőmérsékletű desztillált vízben inkubáltak. A betanin (vörös pigment) kiáramlását 530 nm-en mérték. A 20 °C-os kontroll abszorbanciája 0,05; 40 °C-on 0,08; 60 °C-on 0,45; 80 °C-on 1,20. Egy másik kísérletben 20 °C-on 2% Tween-80 detergens hozzáadásával 0,38-at kaptak. A szeleteket minden esetben azonos ideig mosták a festék kioldása előtt, és a folyadék ozmolaritását nem változtatták. A csoport azt tervezte, hogy a 60 °C-os mintát visszahűti 20 °C-ra, és azt várja, hogy a pigmentkiáramlás „visszafordul”, mert a membránok helyreállnak. A tanár felhívta a figyelmet arra, hogy a növényi sejtekben a sejtfal és a membránok szerkezete is szerepet játszik, és hogy a magas hőmérséklet a fehérjéket is érinti.
1. Értelmezze a hőmérséklet–abszorbancia adatokat! Miért ugrik meg a pigmentkiáramlás 60 °C felett, és miért nem lineáris a növekedés?
Read the worked answer
20 °C-on a membránok szelektív permeabilitása még ép, ezért kevés betanin szökik ki. 40 °C-on kismértékű emelkedés látható: a membránfluiditás nő, a fehérjék egy része károsodhat, de a barrier nagyrészt még működik. 60 °C-on az abszorbancia 0,45-re ugrik, 80 °C-on 1,20-ra nő: ebben a tartományban a membránfehérjék denaturálódnak, a lipidkettős fázisátalakuláson megy át, és a membrán elveszti szelektív permeabilitását. A sejtfal továbbra is jelen van, de a festék kiáramlását elsősorban a membrán állapota szabja meg.
A növekedés azért nem lineáris, mert a fehérjedenaturáció és a lipidfázis-átalakulás együtt, küszöbszerűen következik be. 40 °C és 60 °C között egy viszonylag szűk tartományban sok membránkárosodás történik, ami magyarázza az ugrást. 80 °C-on már szinte valamennyi sejt membránja károsodott, ezért a görbe itt ismét ellaposodhat.
2. Hasonlítsa össze a 20 °C-on detergenssel kapott értéket a hőmérsékleti adatokkal! Mit bizonyít ez a membrán szerkezetéről?
Read the worked answer
A 20 °C-on 2% Tween-80 mellett mért 0,38 közel van a 60 °C-os kezelés 0,45-ös értékéhez, és jóval nagyobb a 20 °C-os kontroll 0,05-ös értékénél. A detergens nem melegíti a mintát, mégis nagymértékű pigmentkiáramlást okoz: ez arra utal, hogy a membrán barrierfunkciójáért elsősorban a lipidkettős a felelős. A detergens a lipidmolekulákat oldja/szolubilizálja, megbontja a kettősréteget, és ezzel permeábilissá teszi a membránt.
A hőmérsékleti kísérlet ehhez képest kétféle károsodást okoz: a lipidek rendezettségének változását és a fehérjék denaturációját. Mivel a detergens főleg a lipidekre hat, a hasonló eredmény megerősíti a fluid-mozaik modellt: a membrán integritása a lipidkettőstől és a benne működő fehérjéktől egyaránt függ. A pontos összehasonlításhoz azonos detergenskoncentráció, azonos inkubációs idő és oldószeres kontroll szükséges.
3. Bírálja meg a visszahűtésre vonatkozó várakozást! Tervezzen mérést annak eldöntésére, hogy a 60 °C-os kezelés visszafordítható-e.
Read the worked answer
A visszahűtés után nem várható, hogy a pigmentkiáramlás a 20 °C-os kontroll szintjére csökkenjen. A lipidfázis-átalakulás részben visszafordulhat, de a 60 °C-on denaturálódott membránfehérjék szerkezete általában nem áll helyre spontán módon, és a membrán barrierfunkciója is tartósan károsodhat. Ezért a 60 °C-os minta visszahűtése után is magas abszorbanciát várunk, legfeljebb kismértékű csökkenést.
Kísérleti terv: azonos méretű szeleteket 20 percig 60 °C-on inkubálunk, majd egy részt azonnal mérünk, egy másikat 20 °C-ra hűtünk, és 20 perc várakozás után mérünk. Kontrollként 20 °C-on tartott, illetve 60 °C-on tartott, de vissza nem hűtött mintákat használunk, három párhuzamosban. Ha a visszahűtött minta abszorbanciája nem csökken szignifikánsan, a károsodás irreverzibilis. Kiegészítő mérésként Evans-kék festéssel vagy vezetőképesség-méréssel is ellenőrizhető a membránintegritás.