Ataque de fagos en una fermentación de 20 000 L de Lactococcus lactis
Una planta produce una bacteriocina mediante fermentación fed-batch de Lactococcus lactis subsp. lactis en un biorreactor de 20 000 L. El lote se detiene a las 10 h porque el pH se queda en 5.9 en lugar de bajar a 4.8, pese a que el inóculo superó los controles de pureza (tinción de Gram, morfología de colonia, catalasa negativa). Un ensayo de placas con la cepa indicadora estándar da 3 × 10³ PFU mL⁻¹ en el caldo; una qPCR dirigida al gen de la terminasa de fagos lactocócicos da 2 × 10⁷ copias de genoma mL⁻¹. El ADN de fago también aparece a 10⁴ copias mL⁻¹ en el condensado del filtro de aire y en el agua de CIP de la campaña anterior, pero no en la leche cruda. La planta rota tres cepas y usa medio M17 suplementado con calcio. Quedan 72 h antes de la siguiente campaña y la dirección pregunta si el lote puede reprocesarse y qué hacer para evitar la recurrencia.
1. Interprete la discrepancia entre el ensayo de placas y la qPCR y decida si el lote puede reprocesarse para recuperar producto.
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Por qué difieren cuatro órdenes de magnitud. La qPCR amplifica ADN de fagos infecciosos, de fagos inactivados y de fragmentos libres, y no distingue entre ellos; además puede detectar fagos que no forman placa en la cepa indicadora elegida. El ensayo de placas, en cambio, subestima si la matriz (bacteriocina, polisacáridos, calcio) inhibe la adsorción, si los fagos se agrupan o si la cepa indicadora no es permisiva para ese fago. Con 3 × 10³ PFU mL⁻¹ ya hay suficiente inóculo para que la infección se amplifique en el fermentador y explique la caída de acidificación; el título de placas es un límite inferior, no una prueba de riesgo bajo.
Reprocesar: no. El producto es un metabolito asociado al crecimiento y a la acidificación; si el pH no descendió, la ruta no se completó y el título es bajo o nulo. Además, el caldo contiene fagos y restos celulares, y no existe un proceso validado que separe el producto del lisado de forma que no disemine el fago por la planta. La decisión correcta es inactivar el lote antes de descargarlo (calor o biocida viricida) y descartarlo, no reintroducirlo en la línea.
2. Proponga el plan de causa raíz y las acciones correctivas que deben ejecutarse en 72 h, incluyendo cómo verificar que la sanitización funcionó antes de reiniciar.
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Fuentes señaladas por los datos. La leche cruda es negativa, mientras que el agua de CIP y el condensado del filtro de aire son positivos: el reservorio más probable es el equipo y la vía aérea, no la materia prima. Un fago persistente en intercambiadores, válvulas o filtros explica que reaparezca con cada campaña.
Acciones en orden de prioridad. (1) Inactivar y descargar el lote con un biocida eficaz frente a fagos (ácido peracético o hipoclorito; el amonio cuaternario es insuficiente). (2) Sustituir los filtros HEPA y revisar fugas y flujo de aire; la planta debe operar con presión positiva en zonas limpias y evitar aerosoles. (3) Desmontar y sanitizar el fermentador y las líneas de CIP, con atención a puntos muertos. (4) Verificar la limpieza con ensayo de placas sobre el agua de enjuague final: criterio <1 PFU mL⁻¹ y ausencia de ADN de terminasa en qPCR. (5) No reiniciar con la cepa usada en las últimas campañas: elegir una cepa no relacionada, idealmente con sistemas CRISPR-Cas o de aborto de infección, y rotar al menos cuatro cepas. (6) Establecer monitoreo de fagos en aire, CIP y materia prima.
Juicio final. Si la verificación con placas no se completa en 72 h, retrasar la campaña; arrancar sin esa evidencia solo repite la pérdida de 20 000 L.