El extracto de higuerilla y el control que faltaba
Un grupo de estudiantes de biología evalúa si un extracto de higuerilla inhibe el hongo Colletotrichum gloeosporioides, causante de antracnosis en mango. Preparan el extracto en etanol al 70 % y lo aplican al 5 % (v/v) sobre medio PDA en tres cajas de Petri. Otras tres cajas reciben únicamente PDA y se rotulan como «control sin tratamiento». Todas las cajas se inoculan con un disco de 5 mm de micelio y se incuban a 25 °C en la misma estufa. A las 72 horas un estudiante mide el diámetro de la colonia: control 42 mm ± 2; tratamiento 25 mm ± 1. La medición la hizo siempre primero el control, sabiendo cuál caja era cuál. El extracto se filtró con papel, pero no se esterilizó; las tres réplicas de cada grupo se tomaron del mismo lote de medio. Los estudiantes concluyen que «el extracto redujo el crecimiento del hongo en un 40 %» y quieren presentarlo en la feria de semilleros.
1. Identifique el principal factor de confusión del diseño y describa exactamente el control que falta.
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El extracto se aplica disuelto en etanol al 70 %, y el grupo control no recibe etanol. El etanol a esa concentración es un antimicrobiano conocido, así que la diferencia de 17 mm no puede atribuirse solo al extracto: es el efecto conjunto del extracto más el vehículo.
El control que falta es un control de vehículo: cajas con PDA a las que se aplican los mismos 200 µL de etanol al 70 % sin extracto, inoculadas e incubadas en las mismas condiciones. Si ese control crece tanto como el control sin tratamiento, el efecto se puede atribuir al extracto; si crece como el tratamiento, todo el efecto es del etanol. Conviene añadir un control de esterilidad: sembrar el extracto filtrado en PDA sin hongo para verificar que no aporta contaminantes, dado que no se esterilizó. Con esos dos controles el diseño permitiría sostener una afirmación causal; sin ellos, la conclusión publicable es mucho más modesta.
2. ¿Qué otras debilidades impiden tratar las tres réplicas de cada grupo como réplicas independientes? Proponga las correcciones.
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Hay al menos cuatro problemas encadenados:
- Seudorreplicación: las tres cajas de cada grupo salen del mismo lote de medio, de modo que no son repeticiones biológicas independientes; la variación entre ellas mide error de manipulación, no variabilidad del fenómeno.
- Sesgo de medición: el observador sabía qué caja era cuál y midió siempre primero el control, lo que permite que su expectativa influya en la lectura del diámetro.
- Falta de esterilidad del extracto: al no filtrarse con membrana, puede haber contaminantes que compitan con el hongo.
- Confusión por posición: dentro de la estufa hay gradientes de temperatura que no se controlaron al asignar las cajas.
Correcciones: réplicas biológicas independientes en distintos días o lotes, medición a ciegas y en orden aleatorio, esterilización por filtración de 0,22 µm, aleatorización de la posición en la estufa y un ensayo con al menos tres concentraciones para observar dosis-respuesta.
3. Con los datos disponibles, ¿cuál es la afirmación más fuerte que el grupo puede sostener y cómo debe expresar el tamaño del efecto?
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Lo máximo sostenible es una afirmación asociativa y descriptiva: «el tratamiento con extracto al 5 % en etanol al 70 % se asoció a un menor diámetro de colonia que el control sin tratamiento», sin atribuir el efecto al extracto, porque el vehículo no está controlado.
Sobre el tamaño del efecto, hay un error de expresión: reducir el diámetro de 42 a 25 mm no es reducir el crecimiento un 40 %. Lo que crece es el área de la colonia, y el área pasó de 1.385 a 491 mm² (πr²), es decir una reducción de aproximadamente 65 %, no de 40 %. Presentar el 40 % subestima el efecto e induce a confusión entre diámetro y biomasa. Además, el resultado es de laboratorio: no dice nada sobre el comportamiento en fruto ni sobre la dosis necesaria en campo. La siguiente etapa debe ser el ensayo con control de vehículo y dosis-respuesta, y solo después una prueba in vivo.