Respiración mitocondrial en un electrodo de oxígeno
Se aíslan mitocondrias de hígado de rata y se resuspenden en un medio con succinato como sustrato. En un electrodo de oxígeno se registra el consumo de O₂ en nmol·min⁻¹·mg⁻¹ de proteína. Al añadir ADP, el consumo sube a 48; cuando el ADP se agota, desciende a 9. Al añadir oligomicina, baja a 7. Al añadir 2,4-dinitrofenol (DNP), sube a 52 y la síntesis de ATP medida por luminiscencia cae prácticamente a cero. Finalmente, al añadir cianuro, el consumo desciende a 1. En un experimento paralelo con glutamato + malato, el consumo en presencia de ADP es de 72. El experimento se realiza a 25 °C y con un exceso de fosfato inorgánico y ADP inicial.
1. Interpreta cada cambio del consumo de oxígeno y decide si la preparación mitocondrial está bien acoplada. Calcula el cociente de control respiratorio (RCR) con succinato.
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El aumento de 9 a 48 al añadir ADP indica que la respiración está acoplada a la síntesis de ATP: el ADP estimula el transporte de electrones porque la ATP sintasa lo utiliza y se regenera el gradiente de protones. El descenso a 9 cuando se agota el ADP corresponde al estado 4, en el que la respiración se destina principalmente a compensar la fuga de protones. La oligomicina inhibe la ATP sintasa y bloquea la entrada de protones por ella; la respiración cae a 7, confirmando el acoplamiento. El DNP es un desacoplante que transporta protones y disipa el gradiente; por eso la respiración sube a 52 mientras la síntesis de ATP cae: los electrones fluyen sin producir ATP. El cianuro inhibe la citocromo c oxidasa y bloquea el transporte de electrones; el consumo cae a 1. El RCR = 48/9 ≈ 5,3, un valor alto, compatible con mitocondrias bien acopladas y funcionales.
2. Explica por qué el glutamato + malato produce un consumo de oxígeno mayor que el succinato y predice qué ocurriría al añadir rotenona en cada caso.
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El glutamato + malato genera NADH, que cede electrones al complejo I; el succinato los cede al complejo II. El complejo I bombea protones al espacio intermembrana, mientras que el complejo II no bombea protones. Por eso, por cada par de electrones, el NADH permite generar un gradiente mayor y sostener una velocidad de transporte de electrones y de consumo de O₂ más alta cuando la demanda de ATP es elevada; de ahí 72 frente a 48. La rotenona inhibe el complejo I. Con glutamato + malato, bloqueará la entrada de electrones y el consumo de O₂ caerá de forma marcada, aunque puede quedar una pequeña respiración residual por otras fuentes. Con succinato, la rotenona no bloquea la entrada por el complejo II, por lo que el consumo de O₂ se mantendrá o incluso aumentará ligeramente si el complejo I no estaba contribuyendo. Este experimento permite distinguir qué complejo está usando cada sustrato.
3. Un estudiante afirma que el DNP “aumenta la respiración y, por tanto, aumenta la producción de ATP”. Refuta la afirmación razonando sobre el gradiente de protones y la ATP sintasa.
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La afirmación confunde el consumo de oxígeno con la síntesis de ATP. La ATP sintasa utiliza la fuerza protón-motriz, es decir, la diferencia de concentración de protones y la diferencia de potencial eléctrico a través de la membrana mitocondrial interna. El DNP transporta protones de vuelta a la matriz sin pasar por la ATP sintasa, de modo que disipa ese gradiente. Como consecuencia, la cadena respiratoria se acelera porque el gradiente se reduce y el bombeo de protones encuentra menos resistencia, pero la energía se libera como calor y no se acopla a la fosforilación del ADP. El resultado experimental es exactamente el observado: el consumo de O₂ sube a 52, pero la síntesis de ATP cae casi a cero. Para producir más ATP no basta con respirar más; hace falta mantener el gradiente y que los protones retornen por la ATP sintasa.