Preparación y diagnóstico de un tampón fosfato para un ensayo enzimático
En el laboratorio de bioquímica de un hospital universitario se preparan 250,0 mL de tampón fosfato de pH 7,40 con una concentración total de fosfato de 0,0500 mol·L⁻¹, a partir de NaH₂PO₄·2H₂O (M = 156,01 g·mol⁻¹) y Na₂HPO₄ anhidro (M = 141,96 g·mol⁻¹). El pKa₂ del H₂PO₄⁻ vale 7,20 a 25 °C. El técnico pesó las sales calculando la masa del dihidrógeno fosfato con la masa molar de la sal anhidra (119,98 g·mol⁻¹) y, al medir con el pH-metro recién calibrado, obtuvo 7,51 en lugar de 7,40. El tampón se destina a una disolución de enzima que solo tolera variaciones de ±0,05 unidades de pH y a la que se añadirán 2,0 mmol de HCl durante el ensayo. El responsable debe decidir si el tampón preparado sirve, si se corrige o si se desecha.
1. Calcula la masa de cada sal necesaria para preparar correctamente los 250,0 mL de tampón pH 7,40.
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Relación de concentraciones (ecuación de Henderson-Hasselbalch): pH = pKa + log([HPO₄²⁻]/[H₂PO₄⁻]) 7,40 = 7,20 + log(r) → log(r) = 0,20 → r = 10^0,20 = 1,585
Es decir, por cada mol de H₂PO₄⁻ hacen falta 1,585 mol de HPO₄²⁻. Como pH − pKa = 0,20 < 1, la aproximación es válida y la disolución tampona bien.
Fosfato total: n_T = 0,0500 mol·L⁻¹ × 0,2500 L = 1,250·10⁻² mol
n(HPO₄²⁻) = 1,585 x; n(H₂PO₄⁻) = x; 2,585 x = 1,250·10⁻² x = 4,84·10⁻³ mol de NaH₂PO₄·2H₂O n(HPO₄²⁻) = 7,66·10⁻³ mol de Na₂HPO₄
Masas: m(NaH₂PO₄·2H₂O) = 4,84·10⁻³ × 156,01 = 0,754 g m(Na₂HPO₄) = 7,66·10⁻³ × 141,96 = 1,088 g
Se disuelven en agua, se ajusta el pH si es necesario con NaOH o H₃PO₄ diluidos y se enrasa a 250,0 mL. Nota: la masa que habría salido usando 119,98 g·mol⁻¹ (0,580 g) es la que efectivamente pesó el técnico, y es errónea porque la sal de partida es un dihidrato.
2. Calcula el pH después de añadir los 2,0 mmol de HCl previstos en el ensayo y valora si el tampón cumple la tolerancia de ±0,05 unidades.
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El HCl convierte base conjugada en ácido: HPO₄²⁻ + H⁺ → H₂PO₄⁻
Nuevas cantidades (en mmol): n(H₂PO₄⁻) = 4,84 + 2,00 = 6,84 mmol n(HPO₄²⁻) = 7,66 − 2,00 = 5,66 mmol El fosfato total no cambia (1,25·10⁻² mol), y el volumen apenas varía.
pH: pH = 7,20 + log(5,66/6,84) = 7,20 + log(0,827) = 7,20 − 0,082 = 7,12
Comprobación exacta con Ka₂ = 10⁻⁷·²⁰ = 6,31·10⁻⁸: [H⁺] = Ka × n(ácido)/n(base) = 6,31·10⁻⁸ × (6,84/5,66) = 7,6·10⁻⁸ mol·L⁻¹ → pH = 7,12. Coincide.
Veredicto: el descenso es de 0,28 unidades, más de cinco veces la tolerancia de ±0,05. El tampón no cumple el requisito del ensayo.
Razonamiento de fondo: la capacidad tamponante depende del número de moles de tampón frente al ácido añadido. Aquí se añaden 2,0 mmol sobre 12,5 mmol totales, un 16 % del tampón: demasiado para una tolerancia tan estrecha. Para cumplirla con este pH habría que aumentar la concentración de fosfato (a ~0,30 mol·L⁻¹ el mismo HCl daría ~0,05 unidades) o, mejor, añadir el HCl como disolución concentrada en volumen mínimo, valorando el pH en continuo.
3. Explica por qué el pH medido fue 7,51 en lugar de 7,40 y decide si conviene corregirlo o desecharlo. Indica el cálculo que lo justifica.
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Diagnóstico: error de masa molar (sal dihidratada tratada como anhidra).
El técnico pesó 0,580 g de NaH₂PO₄·2H₂O, pero esa masa se calculó con M = 119,98. Los moles reales son: n = 0,580 g / 156,01 g·mol⁻¹ = 3,72·10⁻³ mol en lugar de los 4,84·10⁻³ mol previstos: faltan 1,12 mmol de ácido.
pH que predice el modelo: r = 7,66/3,72 = 2,06 → pH = 7,20 + log(2,06) = 7,20 + 0,31 = 7,51
Coincide exactamente con la lectura del pH-metro, lo que confirma el diagnóstico y descarta otras causas (electrodo descalibrado, agua con CO₂, impurezas).
Decisión: se puede corregir, es más rápido y no se pierde material. Hay que añadir los moles que faltan de la sal ácida: Δn = 4,84 − 3,72 = 1,12 mmol → m = 1,12·10⁻³ × 156,01 = 0,175 g de NaH₂PO₄·2H₂O disuelto en poco volumen, ajustando después el pH hasta 7,40 con el pH-metro.
Cuándo desechar: si el tampón se hubiera preparado con la sal anhidra y se hubiese pesado la hidratada (error inverso), o si el volumen no fuese exacto, la corrección a ciegas sería arriesgada; en ese caso se prepara de nuevo. Para un ensayo enzimático con tolerancia de ±0,05 unidades, el criterio profesional es: corregir solo si se puede verificar con pH-metro calibrado con dos patrones (4,01 y 7,00), y repetir la medida tras 10 min de estabilización térmica, ya que el pKa₂ del fosfato tiene un coeficiente térmico de −0,0028 unidades por °C y basta un error de 5 °C para mover el pH en 0,014.