Diagnòstic molecular d'una deleció en BRCA1 i edició selectiva amb CRISPR
Una dona de 35 anys consulta per antecedents familiars de càncer de mama i ovari. La seqüenciació del gen BRCA1 identifica una deleció de 4 parells de bases en un exó codificant (c.68_71del). La variant elimina un lloc de restricció EcoRI (GAATTC) present en l'al·lel wild-type. Per al diagnòstic familiar es dissenya una PCR amb encebadors flanquejants que amplifica un fragment de 520 pb en l'al·lel wild-type i de 516 pb en el mutant. Després de digerir amb EcoRI, el wild-type genera fragments de 320 i 200 pb; el mutant no es talla. La dona és heterozigota. Es planteja una correcció somàtica amb CRISPR/Cas9 en teixit mamari, però també es discuteix el consell genètic i el risc per als fills. Un laboratori proposa editar només l'al·lel mutant per evitar eliminar l'al·lel funcional.
1. Prediu l'efecte de la deleció de 4 pb sobre la proteïna BRCA1 i explica per què la dona pot ser heterozigota.
Read the worked answer
La deleció de 4 pb no és múltiple de 3, de manera que canvia el marc de lectura a partir del punt de la mutació. Els codons posteriors es llegeixen desplaçats, apareixen aminoàcids diferents i, amb molta probabilitat, un codó de parada prematur. La proteïna truncada perd dominis importants (per exemple, els dominis BRCT del BRCA1) i no pot reparar l'ADN per recombinació homòloga. Com que la dona és heterozigota, conserva un al·lel wild-type, suficient per a la funció basal, però el BRCA1 és un gen supressor tumoral: la pèrdua de l'al·lel sa (LOH) en cèl·lules mamàries elimina la proteïna funcional i afavoreix el tumor.
2. Interpreta els resultats esperats de la PCR-RFLP en un control, en la pacient i en un fill portador.
Read the worked answer
Control wild-type: sense digerir, 520 pb; digerit, 320 + 200 pb. Pacient heterozigota: sense digerir, 520 i 516 pb; digerit, 516 pb (al·lel mutant no tallat) + 320 + 200 pb (al·lel wild-type tallat). Un fill portador donaria el mateix patró que la mare. La diferència de 4 pb entre 520 i 516 pot no resoldre's en un gel d'agarosa convencional; per això cal electroforesi d'alta resolució o seqüenciació. La presència de 516 pb després de la digestió confirma la deleció.
3. Avalua la proposta de CRISPR d'editar només l'al·lel mutant.
Read the worked answer
Editar només l'al·lel mutant és desitjable perquè preserva l'al·lel wild-type, però depèn que la deleció generi una seqüència única per al guide RNA i un PAM (per exemple, NGG) present només en el mutant o destruït en el wild-type. Amb 4 pb de diferència, el guide ha de col·locar la deleció dins de la regió seed, prop del PAM; cal verificar in silico i experimentalment els off-targets. A més, l'edició somàtica de teixit mamari és difícil i no elimina el risc de càncer. L'edició germinal no és acceptable èticament. El consell genètic i la vigilància continuen sent la base.