Tampón fosfato para un ensayo enzimático: elegir el par y anticipar la deriva de pH
Un laboratorio de bioquímica debe preparar 500 mL de tampón fosfato de concentración total 0,100 mol·L⁻¹ (suma de especies fosfatadas) a pH 7,20 para un ensayo enzimático. Dispone de H3PO4 (Ka1 = 7,1×10⁻³, Ka2 = 6,3×10⁻⁸, Ka3 = 4,2×10⁻¹³), NaH2PO4·2H2O (M = 156,0 g·mol⁻¹), Na2HPO4 (M = 142,0 g·mol⁻¹) y Na3PO4. El técnico propone usar el par H3PO4/H2PO4⁻ «porque es el primero de la tabla» y ajustar después el pH con HCl. La responsable de calidad advierte de que el ensayo se inhibe por debajo de pH 7,0 y de que, durante el protocolo, se añadirán 2,0 mL de HCl 1,0 mol·L⁻¹ a la disolución. El electrodo se calibró con patrones de pH 4,00 y 7,00. Antes de firmar la preparación, pide justificar el par ácido-base elegido, calcular las masas y estimar la desviación de pH tras la adición de ácido.
1. Justifica qué par conjugado debe usarse y calcula las masas de sus dos sales necesarias para 500 mL de tampón 0,100 mol·L⁻¹ a pH 7,20.
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Un tampón solo funciona bien si pH ≈ pKa (margen útil pKa ± 1).
pKa1 = −log(7,1×10⁻³) = 2,15; pKa2 = −log(6,3×10⁻⁸) = 7,20; pKa3 = 12,38.
El par válido es H2PO4⁻/HPO4²⁻; el H3PO4/H2PO4⁻ propuesto por el técnico tamponaría a pH ≈ 2, y ajustar de 2 a 7 con HCl exigiría neutralizar prácticamente todo el tampón.
Henderson-Hasselbalch: pH = pKa2 + log([HPO4²⁻]/[H2PO4⁻]) ⇒ 7,20 = 7,20 + log r ⇒ r = 1,00 (relación 1:1).
n totales = 0,100 mol·L⁻¹ × 0,500 L = 0,0500 mol ⇒ 0,0250 mol de cada especie.
m(NaH2PO4·2H2O) = 0,0250 × 156,0 = 3,90 g m(Na2HPO4) = 0,0250 × 142,0 = 3,55 g
Se disuelven en agua y se enrasan a 500 mL; no hace falta ajuste con HCl si la pesada es correcta.
2. Calcula el pH tras añadir los 2,0 mL de HCl 1,0 mol·L⁻¹ y decide si el ensayo sigue siendo válido.
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n(HCl) = 0,0020 L × 1,0 mol·L⁻¹ = 2,0×10⁻³ mol de H⁺, que convierten HPO4²⁻ en H2PO4⁻ (reacción prácticamente total, Ka2 pequeña pero el H⁺ es limitante):
n(HPO4²⁻) = 0,0250 − 0,0020 = 0,0230 mol n(H2PO4⁻) = 0,0250 + 0,0020 = 0,0270 mol
pH = 7,20 + log(0,0230/0,0270) = 7,20 + log(0,852) = 7,20 − 0,070 = 7,13
El volumen final (502 mL) no interviene: en Henderson-Hasselbalch solo cuenta la relación de concentraciones y ambas se diluyen igual.
Decisión: 7,13 > 7,00, el ensayo es válido, pero el margen es de solo 0,13 unidades frente al límite de inhibición. Conviene duplicar la concentración del tampón a 0,200 mol·L⁻¹ (misma relación 1:1), lo que reduciría la deriva a ≈ −0,035 unidades y daría margen real.
3. ¿Qué ocurriría si, por error, se añadieran 20 mL de HCl 1,0 mol·L⁻¹? Extrae una conclusión sobre la capacidad tampón y sobre la calibración del electrodo.
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n(H⁺) = 0,020 mol frente a 0,0250 mol de HPO4²⁻ disponibles: se consumiría el 80 % de la base conjugada y quedaría HPO4²⁻ = 0,0050 mol, H2PO4⁻ = 0,0450 mol.
pH = 7,20 + log(0,0050/0,0450) = 7,20 − 0,954 = 6,25
El tampón está agotado en la práctica (relación 1:9) y el pH cae más de una unidad: el ensayo se inhibe. La capacidad tampón es finita y proporcional a la concentración del tampón, no a su pH: por eso 0,100 mol·L⁻¹ es frágil frente a adiciones grandes y hay que dimensionar la concentración con la carga ácida esperada.
Sobre la calibración: el electrodo se ajustó con 4,00 y 7,00 y la lectura útil está en 7,1–7,2, inmediatamente por encima del patrón alto. Es aceptable, pero un segundo patrón de 10,00 reduciría la incertidumbre; además, un tampón 0,1 mol·L⁻¹ tiene fuerza iónica apreciable y el pH medido es operativo, no termodinámico.