Cinética de una fosfatasa alcalófila: ¿inhibición competitiva o no competitiva?
Un equipo de un laboratorio de biología marina de Cantabria purifica una fosfatasa alcalina de una bacteria marina alcalófila. Para caracterizarla, mide la velocidad inicial de hidrólisis del sustrato p-nitrofenilfosfato (pNPP) a 25 °C y pH 9,5, variando la concentración de sustrato: con 1 mM obtiene 33 µmol·min⁻¹, con 2 mM 50, con 4 mM 67 y con 8 mM 80. Cuando repite la serie añadiendo 2 mM de un compuesto X, los valores son 20, 33, 50 y 67, respectivamente. A pH 9,5, pero con 10 minutos de preincubación a 55 °C, la actividad cae un 85 %. Si el ensayo se realiza a pH 7,4, todas las velocidades disminuyen aproximadamente un 40 %. La enzima conserva actividad tras diálisis frente a tampón sin sustrato, pero la pierde si se dializa frente a EDTA 5 mM. El equipo debe decidir si el compuesto X es útil como inhibidor para estudios cinéticos y cómo explicar el efecto del pH y del EDTA.
1. A partir de los datos cinéticos, determine Vmax y Km aparentes en ausencia y presencia de X, identifique el tipo de inhibición y calcule Ki. Justifique el razonamiento.
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Sin X, la velocidad se aproxima a 100 µmol·min⁻¹ y se alcanza 50 (Vmax/2) a 2 mM, por lo que Vmax ≈ 100 y Km ≈ 2 mM. Con X, 50 se alcanza a 4 mM y la velocidad a 8 mM sigue por debajo de 100, pero se aproxima al mismo Vmax; por tanto, Km aparente = 4 mM y Vmax no cambia. El patrón -Km aparente mayor, Vmax igual- corresponde a inhibición competitiva. De Km ap = Km(1 + [I]/Ki): 4 = 2(1 + 2/Ki); 2 = 1 + 2/Ki; Ki = 2 mM. La representación de Lineweaver-Burk daría rectas que cortan el eje y en el mismo punto (1/Vmax = 0,01) y el eje x en −0,5 y −0,25 mM⁻¹. X se une al sitio activo y puede desplazarse aumentando [S]; sería útil para estudiar el sitio activo, pero no para lograr una inhibición insuperable.
2. Explique a nivel molecular por qué la actividad es mayor a pH 9,5 que a pH 7,4 y por qué el EDTA inactiva la enzima. ¿Qué experimento permitiría distinguir si el EDTA desnaturaliza o solo retira un cofactor?
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El pH modifica la ionización de cadenas laterales del centro activo. A pH 7,4 residuos con pKa cercano a 8-9 (Lis, Cys, Tyr) están protonados y pueden no actuar como base o ácido general; a pH 9,5 se desprotonan y recuperan la actividad. También cambia la carga del pNPP, que a pH alcalino es un dianión y se une mejor a un bolsillo con Arg y Lis. El EDTA quelata cationes divalentes; la pérdida de actividad tras diálisis sugiere que Mg²⁺ o Zn²⁺ es cofactor. Para distinguir quelación de desnaturalización, tras dializar con EDTA se añade MgCl₂ o ZnCl₂ en exceso y se mide la recuperación. Si la actividad vuelve, el EDTA solo retiró el metal de forma reversible; si no vuelve, y además cambian el dicroísmo circular o la fluorescencia intrínseca, hubo desnaturalización. Conviene repetir con EDTA sin diálisis para separar la quelación de la eliminación del metal.