Acoplamiento mitocondrial: interpretar oligomicina, DNP, cianuro y atractilósida
En una práctica de fisiología se aíslan mitocondrias de hígado de rata y se resuspenden en tampón con piruvato, malato, fosfato y Mg²⁺. Se mide el consumo de O₂ con un electrodo de Clark. En estado basal se registran 8 nmol O₂·min⁻¹. Al añadir 0,5 mM ADP, el consumo sube a 42 nmol O₂·min⁻¹ y se mantiene mientras queda ADP; en ese intervalo se valoran 210 nmol de ATP·min⁻¹. La oligomicina reduce el consumo a 10. Si después se añade 2,4-dinitrofenol (DNP), el consumo asciende a 55 y la síntesis de ATP es indetectable. La adición final de cianuro deja el consumo en 2. En un experimento paralelo, la atractilósida (inhibidor del transportador ADP/ATP) aplicada antes del ADP mantiene el consumo en 9 y no se detecta ATP. El responsable de la práctica debe decidir si las mitocondrias están acopladas, interpretar cada inhibidor y valorar si el DNP sirve como control de desacoplamiento.
1. Calcule la relación P/O en presencia de ADP e interprete si las mitocondrias están acopladas. ¿Por qué el piruvato y el malato permiten ese valor?
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El consumo se mide como O₂, y cada O₂ aporta dos átomos de oxígeno; el flujo de átomos es 2 × 42 = 84 nmol·min⁻¹. P/O = 210/84 = 2,5 mol de ATP por mol de átomos de oxígeno. Ese valor es coherente con la entrada de electrones por el complejo I (NADH), como ocurre con piruvato y malato, y no con succinato, que daría alrededor de 1,5. La respiración basal baja (8) indica que la fuerza protón-motriz frena el flujo; al añadir ADP, la ATP sintasa consume el gradiente y la cadena acelera: hay acoplamiento respiratorio. La relación P/O próxima a la teórica indica que la mayor parte del bombeo de protones se emplea en fosforilar ADP y no se pierde por fugas de la membrana interna.
2. Explique el efecto de la oligomicina, del DNP, del cianuro y de la atractilósida sobre la respiración y la síntesis de ATP.
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La oligomicina inhibe la subunidad F0 de la ATP sintasa: sin salida de protones, el gradiente se mantiene y la cadena se frena. Por eso solo baja la respiración cuando hay ADP que fosforilar; sin ADP, el sistema ya está frenado. El DNP transporta protones a través de la membrana interna, disipa el gradiente y desacopla: la cadena funciona al máximo (55) porque no hay contrapresión, pero no se sintetiza ATP y la energía se disipa como calor. El cianuro se une al citocromo c oxidasa (complejo IV) y bloquea la transferencia de electrones al O₂; cesa el bombeo de protones y la respiración cae a 2. La atractilósida impide la entrada de ADP por el transportador mitocondrial; sin sustrato para la ATP sintasa, el gradiente frena la cadena (9) y no hay ATP, lo que demuestra que el efecto del ADP requiere su transporte al interior.
3. El responsable propone usar DNP como control positivo de desacoplamiento en todas las muestras. Valore la propuesta y proponga una alternativa más adecuada.
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El DNP es un desacoplante clásico, pero como control es poco específico y tóxico: actúa sobre cualquier membrana, tiene un margen estrecho y puede alterar el pH citosólico. Para un control de desacoplamiento en mitocondrias aisladas es preferible CCCP o FCCP a concentraciones bajas, comprobando una respuesta dosis-dependiente. Debe verificarse que el consumo vuelve a bajar con oligomicina y que la membrana mantiene su integridad, por ejemplo con un ensayo de potencial de membrana o de retención de un colorante. Como control positivo de viabilidad mitocondrial puede servir, pero no para cuantificar el acoplamiento en muestras clínicas ni para comparar muestras con distinta composición lipídica.