Conjugación plasmídica de blaKPC entre Klebsiella pneumoniae y E. coli
En el servicio de Microbiología de un hospital de Cantabria se aísla Klebsiella pneumoniae Kp-17 resistente a meropenem (CIM >32 mg/L) de un paciente con neumonía. Se sospecha una carbapenemasa KPC. Para demostrar la transferencia, se realiza un ensayo de conjugación en caldo: donante Kp-17 (resistente a meropenem, sensible a rifampicina) a 4×10⁷ UFC/mL; receptor E. coli J53 (sensible a meropenem, resistente a rifampicina y azida sódica) a 8×10⁸ UFC/mL. Tras 2 h a 37 °C, se plaquea en agar con meropenem 2 mg/L, rifampicina 100 mg/L y azida 100 mg/L, y se obtienen 320 colonias. Un control con DNasa I (100 µg/mL) da 305 colonias; un control sin donante da 0. La PCR de la cepa transconjugante amplifica blaKPC. El laboratorio debe interpretar la frecuencia de transferencia, descartar mecanismos alternativos y valorar el riesgo de diseminación en la unidad.
1. Calcule la frecuencia de transferencia por donante y por receptor e interprete los controles.
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La frecuencia por donante es 320/(4×10⁷) = 8×10⁻⁶ transconjugantes por UFC de donante; por receptor, 320/(8×10⁸) = 4×10⁻⁷. Es una transferencia detectable pero no masiva, compatible con un plásmido conjugativo. El control con DNasa I no reduce el número de colonias (305), lo que descarta transformación por ADN libre; el control sin donante da 0, lo que descarta contaminación del receptor o recombinación espontánea. La selección triple exige que la colonia sea receptora (rifampicina y azida) y haya adquirido el plásmido (meropenem): el donante muere por rifampicina o azida y el receptor por meropenem. La PCR de blaKPC en el transconjugante confirma que el determinante se transfirió. El hecho de que el receptor sea E. coli indica que el plásmido cruza géneros, lo que aumenta el riesgo de diseminación.
2. Explique por qué la selección con meropenem, rifampicina y azida permite aislar transconjugantes y por qué la DNasa no afecta al resultado.
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El receptor J53 es resistente a rifampicina y azida, pero sensible a meropenem; el donante Kp-17 es resistente a meropenem, pero sensible a rifampicina. Solo una célula que sea J53 y haya recibido el plásmido con blaKPC crecerá en el medio con los tres agentes. El donante no crece por rifampicina y azida, y el receptor no crece por meropenem; los transconjugantes sí, porque expresan la carbapenemasa. La DNasa degrada ADN libre en el medio, pero no penetra en las células ni afecta al contacto célula-célula que requiere la conjugación. Como el número de colonias no cambia con DNasa, se descarta que la resistencia se haya adquirido por transformación natural. El control sin donante es esencial para descartar mutantes espontáneos del receptor.
3. Se detecta blaKPC por PCR en una muestra de agua residual del hospital. ¿Puede concluirse que hay bacterias resistentes viables? Razone la respuesta y proponga cómo comprobarlo.
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La PCR detecta ADN, no viabilidad. En agua residual, blaKPC puede provenir de células muertas, de ADN extracelular o de bacterias viables no cultivables. Para valorar el riesgo sanitario hay que combinar cultivo en medios selectivos con meropenem, cuantificación por qPCR y controles de viabilidad, como el tratamiento con propidio monoazida antes de la PCR. Si se amplifica el gen, conviene secuenciar el amplicón y tipar el plásmido para comprobar que es el mismo que el de Kp-17. Un positivo por PCR justifica investigar y reforzar la limpieza, pero no demuestra por sí solo que haya bacterias resistentes viables capaces de colonizar o infectar.