Inhibidor competitivo y termoestabilidad de una deshidrogenasa bacteriana
En un laboratorio de bioquímica se caracteriza una deshidrogenasa purificada a partir de una bacteria termófila. Los ensayos se realizan a 25 °C y a 60 °C con concentraciones crecientes de sustrato, y los datos ajustan a la ecuación de Michaelis-Menten; el sustrato se mantiene a concentración saturante salvo cuando se indica. A 60 °C, en ausencia de inhibidores, se obtiene Vmax = 100 µmol·min⁻¹·mg⁻¹ y Km = 0,5 mM. Al añadir un inhibidor X 2 mM, la Vmax no cambia, pero la Km aparente pasa a 1,5 mM. A 25 °C, con el mismo sustrato, la Vmax es solo 4 µmol·min⁻¹·mg⁻¹. Por encima de 75 °C la actividad cae bruscamente y no se recupera al volver a 60 °C. Una variante de la enzima con una sustitución de una histidina del centro activo muestra una Km de 50 mM sin cambios en la Vmax.
1. Identifica el tipo de inhibición que produce X y justifica la respuesta con los parámetros cinéticos. Calcula la velocidad de reacción a [S] = 0,5 mM en ausencia y en presencia del inhibidor y explica si el efecto se puede revertir aumentando la concentración de sustrato.
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Inhibición competitiva. La Vmax no cambia (100 µmol·min⁻¹·mg⁻¹) mientras que la Km aparente se triplica (0,5 → 1,5 mM): el inhibidor se une al centro activo e impide la unión del sustrato, pero no altera la conversión catalítica una vez que el sustrato sí se ha unido. En una representación de Lineweaver-Burk (1/v frente a 1/[S]) las rectas con y sin inhibidor cortan el eje de ordenadas en el mismo punto (1/Vmax) y la pendiente (Km/Vmax) aumenta.
Cálculo con v = Vmax·[S]/(Km + [S]):
- Sin inhibidor: v = 100 × 0,5 / (0,5 + 0,5) = 50 µmol·min⁻¹·mg⁻¹.
- Con inhibidor: v = 100 × 0,5 / (1,5 + 0,5) = 25 µmol·min⁻¹·mg⁻¹.
A [S] = 0,5 mM la velocidad se reduce a la mitad, pero a [S] = 10 mM sería de 95 frente a 87 µmol·min⁻¹·mg⁻¹: al aumentar la concentración de sustrato la competición se desplaza a favor del sustrato y el efecto desaparece. Por tanto la inhibición es reversible y superable.
2. Interpreta el comportamiento de la enzima a 25 °C, a 60 °C y por encima de 75 °C, y explica por qué la actividad no se recupera al volver a 60 °C.
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Entre 25 y 60 °C la actividad aumenta: la temperatura eleva la energía cinética de las moléculas, hay más colisiones con energía suficiente y más moléculas alcanzan el estado de transición; en ese intervalo el cociente Q10 ronda 2. A 25 °C la enzima está lejos de su óptimo, propio de un organismo termófilo, y por eso la Vmax es solo 4 µmol·min⁻¹·mg⁻¹.
Por encima de 75 °C la actividad cae en picado porque se rompen las interacciones no covalentes (puentes de hidrógeno, interacciones iónicas, regiones hidrofóbicas) que mantienen el plegamiento, se desnaturaliza el centro activo y se pierde la conformación funcional. La falta de recuperación al volver a 60 °C indica que la desnaturalización es irreversible en estas condiciones: no se trata de una simple inhibición térmica reversible, sino de un daño estructural permanente. La elevada Vmax a 60 °C no contradice el modelo de Michaelis-Menten, pues los parámetros cinéticos se midieron a esa temperatura y son válidos solo para ella.
3. La variante con la histidina sustituida presenta Km = 50 mM y la misma Vmax. Explica qué significa la Km, qué se deduce sobre el papel de ese residuo y qué consecuencia tendría para la célula.
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La Km es la concentración de sustrato para la que v = Vmax/2; es una medida inversa de la afinidad aparente de la enzima por el sustrato. Si la Vmax y, por tanto, la kcat no cambian, la catálisis sigue intacta y lo que se altera es la unión del sustrato: un aumento de Km de 0,5 a 50 mM (100 veces) indica que la histidina sustituida participa en el reconocimiento o en la estabilización del sustrato en el centro activo, no en el paso catalítico. Podría tratarse de un residuo que forma un puente de hidrógeno con el sustrato o que contribuye a su correcta ionización.
Consecuencia fisiológica: si la concentración intracelular de sustrato es del orden de 0,1-1 mM, la enzima mutada trabaja muy por debajo de su Vmax y el flujo de la vía disminuye drásticamente; la velocidad pasaría a depender casi linealmente de [S] y la célula solo compensaría el déficit sobreexpresando la enzima o acumulando sustrato.