Validation d'une quantification par qPCR
Un laboratoire de biotechnologie quantifie un ADN cible par PCR quantitative. La gamme étalon donne la relation Ct = −3,32 log10(N) + 38,5, avec N en copies par réaction et R² = 0,998. L'échantillon est dilué au 1/10 et analysé en duplicate : Ct = 27,7 et 27,9. Le volume d'ADN déposé par réaction est de 5,0 µL. Le témoin négatif sans matrice (NTC) donne Ct = 33,9 ; le témoin positif donne Ct = 22,1, conforme à sa valeur attendue. Les critères d'acceptation du laboratoire sont : pente de la gamme entre −3,1 et −3,6 ; écart entre duplicats ≤ 0,5 ; NTC non déterminé ou Ct > 35. Le technicien veut rendre un résultat quantitatif. Il se demande si le run est valide, quelle concentration calculer et ce qu'il faut refaire avant de signer le rapport.
1. Calculer le nombre de copies par réaction pour l'échantillon, puis la concentration en copies par µL dans l'échantillon non dilué. Les duplicats sont-ils acceptables ?
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La moyenne des duplicats est $\bar{Ct}=27,8$, avec un écart $\Delta Ct=0,2$, inférieur au critère de 0,5 : les duplicats sont acceptables.
On utilise $Ct=-3,32\log_{10}N+38,5$, donc
$$\log_{10}N=\frac{38,5-27,8}{3,32}=\frac{10,7}{3,32}\approx 3,223.$$
$N=10^{3,223}\approx 1,67\times 10^3$ copies par réaction. Ces copies sont contenues dans 5,0 µL de l'échantillon dilué au 1/10, soit une concentration de $1,67\times 10^3/5,0\approx 334$ copies·µL⁻¹ dans la dilution. L'échantillon non dilué est dix fois plus concentré : environ $3,34\times 10^3$ copies·µL⁻¹, soit $3,34\times 10^6$ copies·mL⁻¹.
2. Le run respecte-t-il les critères ? Justifier à partir de la pente, des duplicats et du NTC. Peut-on publier la concentration calculée ?
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La pente vaut −3,32, comprise entre −3,1 et −3,6 : critère respecté. Les duplicats ont un écart de 0,2 : critère respecté. En revanche, le NTC donne Ct = 33,9, donc un signal détecté avant 35 : le critère d'acceptation n'est pas respecté.
Ce signal correspond à $N_{\text{NTC}}=10^{(38,5-33,9)/3,32}=10^{1,386}\approx 24$ copies par réaction, soit environ 1,5 % du signal de l'échantillon. L'échantillon est beaucoup plus concentré, mais le run est contaminé. On ne peut pas valider une quantification avec un témoin négatif positif, surtout si l'on doit quantifier des faibles charges ou comparer des échantillons. Le résultat de 3,34×10⁶ copies·mL⁻¹ est indicatif, pas publiable en l'état.
3. Proposer deux causes probables de l'amplification du NTC et un plan de reprise incluant un contrôle supplémentaire.
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Deux causes probables sont : une contamination des réactifs, de l'eau ou du mélange réactionnel par de l'amplicon ou de l'ADN génomique ; ou une contamination croisée par pipetage, par exemple un puits voisin très concentré ou un cône réutilisé. Il faut aussi vérifier la courbe de fusion : un produit non spécifique, comme un dimère d'amorces, peut donner un signal tardif et faire croire à une contamination.
Plan de reprise : utiliser de nouveaux aliquotes de réactifs et d'eau, changer de cônes filtres et de gants, décontaminer la paillasse et le portoir, puis refaire une gamme étalon et l'échantillon en duplicate. Ajouter un contrôle d'extraction (blank) et un NTC supplémentaire en fin de plaque. Si la courbe de fusion du NTC ne correspond pas au produit cible, le signal est non spécifique ; sinon, il s'agit d'une vraie contamination et le run doit être refait avant tout rendu de résultat.