Optimum temperatury amylazy - co naprawdę zmierzył uczeń
Uczeń badał aktywność amylazy z ekstraktu kiełków pszenicy. Do sześciu probówek odmierzył po 5 cm³ 1% roztworu skrobi w buforze fosforanowym o pH 6,8 i umieścił je w łaźniach wodnych o temperaturach 20, 30, 40, 50, 60 i 70 °C. Po 15 minutach do każdej probówki dodał 0,5 cm³ ekstraktu przechowywanego w temperaturze 4 °C i co 30 sekund pobierał kroplę mieszaniny na płytkę z roztworem jodu. Zanik granatowego zabarwienia uznał za koniec reakcji. Uzyskał czasy: 20 °C - 11 min, 30 °C - 5,5 min, 40 °C - 3 min, 50 °C - 2 min, 60 °C - 1,5 min, 70 °C - brak zaniku po 20 min. W sprawozdaniu napisał: „Optimum temperatury amylazy wynosi 60 °C, ponieważ w tej temperaturze reakcja zakończyła się najszybciej”. Nauczyciel zwrócił uwagę, że wynik dla 60 °C może opisywać coś innego niż optimum katalityczne, i poprosił o krytyczną analizę doświadczenia.
1. Oceń poprawność wniosku ucznia. Odwołaj się do dwóch przeciwstawnych procesów zachodzących w podwyższonej temperaturze oraz do tego, co dokładnie mierzy zastosowana metoda.
Read the worked answer
Wniosek jest nieuprawniony, bo metoda mierzy punkt końcowy (czas do zaniku zabarwienia), a nie szybkość początkową reakcji. Na ten czas składają się dwa przeciwne procesy: wzrost szybkości katalizy wraz z temperaturą (więcej cząsteczek ma energię powyżej bariery aktywacji) oraz postępująca denaturacja, która usuwa aktywny enzym z reakcji. Przy 60 °C enzym prawdopodobnie pracuje najszybciej w pierwszych sekundach, ale równocześnie szybko traci aktywność, więc czas 1,5 min jest wypadkową obu procesów. Przy 70 °C denaturacja zachodzi szybciej niż hydroliza i barwa nie znika wcale. Dane nie pozwalają rozstrzygnąć, czy optimum szybkości początkowej leży przy 60, 65 czy 70 °C - brakuje pomiarów w pierwszych sekundach. Uczeń może co najwyżej twierdzić, że w warunkach jego doświadczenia reakcja kończyła się najszybciej w 60 °C. Dodatkowo brak powtórzeń, brak kontroli pH w temperaturze i różne tempo pobierania próbek osłabiają wiarygodność.
2. Zaproponuj dwie konkretne modyfikacje doświadczenia, które pozwolą wyznaczyć temperaturę optimum dla szybkości początkowej reakcji.
Read the worked answer
- Mierzyć szybkość początkową, a nie czas do końca: pobierać próbki co 10–15 s w pierwszych 60 s i wyznaczyć nachylenie krzywej w fazie liniowej (albo prowadzić pomiar ciągły spektrofotometrycznie w kiuwecie termostatowanej, np. przy 620 nm po dodaniu jodu). Wtedy zamiast jednego punktu otrzymujemy v = ΔA/Δt.
- Rozdzielić wpływ temperatury na szybkość od wpływu na trwałość enzymu: preinkubować enzym w danej temperaturze przez 5 min, a następnie oznaczyć jego aktywność w standardowej temperaturze 30 °C - otrzymamy krzywą stabilności termicznej, niezależną od kinetyki. Uzupełniająco: wykonać po trzy powtórzenia dla każdej temperatury, użyć tego samego stężenia enzymu i substratu, kontrolować pH buforu (pH zależy od temperatury), a próbki pobierać automatycznie pipetą o stałej objętości.
3. Zaproponuj sposób sprawdzenia, że brak zaniku zabarwienia przy 70 °C wynika z denaturacji enzymu, a nie z braku skrobi lub błędu w przygotowaniu probówki.
Read the worked answer
Potrzebne są kontrole wykluczające poszczególne wyjaśnienia:
- Kontrola negatywna: probówka z substratem i enzymem wcześniej zagotowanym (10 min w 100 °C), inkubowana w 70 °C - jeśli barwa także nie znika, to nie brak skrobi jest przyczyną, bo skrobia jest obecna i wykrywalna jodem.
- Kontrola samego podłoża: probówka bez enzymu w 70 °C; sprawdzamy, czy sama temperatura nie spowodowała hydrolizy skrobi.
- Test nieodwracalności: próbkę z 70 °C ostudzić do 40 °C i dodać świeży substrat - brak aktywności po ostudzeniu potwierdza nieodwracalną denaturację, a nie chwilowe obniżenie aktywności.
- Kontrola pipetowania: oznaczyć stężenie białka w każdej probówce, by wykluczyć, że do probówki 70 °C nie trafił enzym. Dopiero zgodny wynik tych kontroli pozwala przyjąć denaturację jako wyjaśnienie.