Inhibición enzimática de la fosfatasa alcalina
Un laboratorio estudia la fosfatasa alcalina intestinal con el sustrato sintético p-nitrofenilfosfato. Se mide la velocidad inicial (v0, en µmol de producto por minuto) a distintas concentraciones de sustrato, en ausencia y en presencia de un inhibidor a concentración fija de 4 µM. Los resultados son: [S] 0,5 mM: v0 11,1 sin inhibidor y 5,6 con inhibidor; [S] 1 mM: 20,0 y 10,0; [S] 2 mM: 33,3 y 16,7; [S] 4 mM: 50,0 y 25,0; [S] 8 mM: 66,7 y 33,3. El inhibidor no se parece estructuralmente al sustrato y se une a una región distinta del centro activo. Un estudiante propone aumentar la concentración de sustrato hasta 50 mM para recuperar la actividad normal. Se asume que la enzima sigue el modelo de Michaelis-Menten y que el inhibidor no altera la unión del sustrato de forma irreversible.
1. Determina, a partir de los datos, el tipo de inhibición. ¿Qué parámetro cinético cambia y cuál no?
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Para diagnosticar el tipo de inhibición conviene usar la representación de Lineweaver-Burk (1/v frente a 1/[S]) o comparar los parámetros.
Sin inhibidor, los datos se ajustan a v = Vmax[S]/(Km + [S]) con Vmax = 100 µmol/min y Km = 4 mM. Con inhibidor, Vmax cae a 50 µmol/min, mientras que la Km aparente sigue siendo 4 mM.
En el doble recíproco, la ordenada en el origen pasa de 0,010 a 0,020 (1/Vmax), y la pendiente se duplica, pero la intersección con el eje x (−1/Km) no cambia: −0,25 mM⁻¹. Eso corresponde a una inhibición no competitiva pura: el inhibidor reduce la velocidad máxima sin impedir la unión del sustrato. Si fuera competitiva, Vmax no cambiaría y la Km aparente aumentaría.
2. Calcula Km y Vmax en ausencia y en presencia del inhibidor, mostrando el procedimiento.
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Con la representación de doble recíproco: sin inhibidor, 1/Vmax = 0,010, luego Vmax = 100 µmol/min; la pendiente es Km/Vmax = 0,040, luego Km = 0,040 × 100 = 4 mM.
Con inhibidor, 1/Vmax = 0,020, luego Vmax = 50 µmol/min; la pendiente es 0,080, luego Km aparente = 0,080 × 50 = 4 mM.
También puede comprobarse con un punto experimental: a [S] = 4 mM, sin inhibidor v = 100 × 4/(4 + 4) = 50; con inhibidor v = 50 × 4/(4 + 4) = 25. La afinidad por el sustrato no cambia; lo que se reduce a la mitad es la velocidad máxima, porque el inhibidor disminuye la actividad catalítica de una fracción de las moléculas enzimáticas.
3. Evalúa la propuesta del estudiante de añadir sustrato hasta 50 mM. ¿Se recuperaría la actividad normal?
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No. En una inhibición no competitiva, al aumentar [S] se saturan las enzimas que siguen activas, pero la fracción inhibida no se recupera. A [S] → ∞, la velocidad tiende a Vmax/2, no a Vmax.
A 50 mM, sin inhibidor: v = 100 × 50/(4 + 50) = 92,6 µmol/min. Con inhibidor: v = 50 × 50/(4 + 50) = 46,3 µmol/min, aproximadamente la mitad. El inhibidor se une a un sitio distinto del centro activo y reduce la actividad catalítica; no compite con el sustrato. Solo se reduciría el efecto disminuyendo la concentración de inhibidor o retirándolo, no añadiendo más sustrato.