Halos de inhibición y resistencia transferible en un laboratorio escolar
En el laboratorio de un instituto de Torrelavega, un alumno compara la resistencia de una cepa de laboratorio de Escherichia coli K-12 y de un aislado ambiental de una balsa de purines frente a ampicilina y tetraciclina. Usa discos de 30 µg y siembra en césped. Resultados de diámetro de halo: cepa K-12, ampicilina 20 mm, tetraciclina 18 mm; aislado ambiental, ampicilina 6 mm, tetraciclina 19 mm. El alumno concluye que la tetraciclina es más eficaz que la ampicilina en ambas cepas y que el aislado ambiental es resistente a ampicilina. No incluyó un disco sin antibiótico ni una placa con disolvente. El profesor le pide revisar la conclusión antes de presentarla en la feria científica. El centro dispone de incubadora, espectrofotómetro, placas, medios y material de biología molecular básico, pero no de un laboratorio de diagnóstico clínico.
1. Evalúa la conclusión del alumno sobre la eficacia comparada de ampicilina y tetraciclina.
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La comparación directa de halos no es válida. El diámetro de inhibición depende del antibiótico, de su tamaño molecular, carga y difusión en agar, de la concentración del disco y de los puntos de corte clínicos, no solo de la potencia. Un halo de 20 mm con ampicilina y 18 mm con tetraciclina no significa que la ampicilina sea más eficaz. Para E. coli, con discos de 30 µg, puntos de corte orientativos sitúan ampicilina resistente en ≤13 mm y tetraciclina resistente en ≤11 mm; con esos valores, la cepa K-12 sería sensible a ambos y el aislado ambiental sería resistente a ampicilina, con 6 mm, y sensible a tetraciclina, con 19 mm. La conclusión correcta es que el aislado ambiental es resistente a ampicilina y sensible a tetraciclina, no que la tetraciclina sea «más eficaz». Faltan controles y estandarización del inóculo.
2. Explica para qué sirven los controles que faltan y cómo cambiarían la interpretación.
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Los controles faltantes son un disco blanco sin antibiótico, o con el disolvente, para descartar que el papel o el disolvente inhiban; una placa sin inóculo para comprobar esterilidad; y una cepa de referencia con sensibilidad conocida para validar discos y medio. También hay que estandarizar el césped a 0,5 McFarland, el grosor del agar, la temperatura y el tiempo de incubación. Sin el disco blanco, un halo podría deberse al vehículo; sin la cepa de referencia, no se sabe si los discos conservan potencia. Si el disco blanco produce halo, la conclusión de resistencia queda invalidada. Si la cepa de referencia falla, hay que repetir el ensayo.
3. Propón un experimento para determinar si la resistencia a ampicilina del aislado ambiental es transferible por plásmido, con las limitaciones de bioseguridad del centro.
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Para probar transferencia por plásmido, usar como donante el aislado ambiental y como receptora una cepa de E. coli K-12 no patógena resistente a rifampicina; mezclar en caldo, incubar y sembrar en placas con ampicilina y rifampicina. Solo crecerán transconjugantes si el gen de resistencia pasó. Controles: donante solo, que no debe crecer en rifampicina; receptora sola, que no debe crecer en ampicilina; y mezcla sin selección. Confirmar el plásmido por extracción alcalina y gel, o por PCR de blaTEM si hay material. Bioseguridad: el aislado ambiental puede ser patógeno; trabajar con guantes, autoclave y sin abrir placas innecesariamente. Si el centro no tiene nivel 2, no hacer conjugación con el aislado ambiental; usar solo cepas K-12.