Elegir tampón para un ensayo enzimático con calcio a 37 °C
Un laboratorio de bioquímica debe preparar 500 mL de tampón para un ensayo enzimático que se realiza a 37 °C y pH 7,40. La mezcla contiene además 1,0 mM de CaCl2 y el enzima necesita calcio libre para conservar su actividad. El técnico dispone de fosfato potásico (pKa2 = 7,20 a 25 °C) y de Tris, que preparará a partir de Tris base sólido (M = 121,1 g·mol⁻¹) y Tris·HCl sólido (M = 157,6 g·mol⁻¹). El pKa del Tris es 8,06 a 25 °C y disminuye 0,031 unidades por cada grado que sube la temperatura. La concentración total de tampón debe ser 20 mM. El protocolo exige ajustar el pH a la temperatura de trabajo, pero un compañero ya dejó valorado el tampón a 25 °C y guardado en nevera. Datos: Ka3(H3PO4) = 4,2·10⁻¹³; Kps(Ca3(PO4)2) = 2,0·10⁻³³.
1. Calcula las masas de Tris base y de Tris·HCl necesarias para preparar el tampón 20 mM a pH 7,40 ajustado a 25 °C.
Read the worked answer
Henderson-Hasselbalch: pH = pKa + log([Tris]/[TrisH⁺])
7,40 = 8,06 + log r → log r = −0,66 → r = 10^(−0,66) = 0,219
Cantidad total de amina: n = 0,020 mol·L⁻¹ × 0,500 L = 0,0100 mol
- n(Tris) = 0,0100 × 0,219/1,219 = 1,80·10⁻³ mol → m = 1,80·10⁻³ × 121,1 = 0,218 g
- n(Tris·HCl) = 0,0100 − 1,80·10⁻³ = 8,20·10⁻³ mol → m = 8,20·10⁻³ × 157,6 = 1,29 g
Se disuelven en unos 400 mL de agua desionizada, se ajusta el pH con HCl 1,00 M (el HCl solo convierte parte del Tris base en el ácido conjugado, por lo que hay que reajustar) y se enrasa a 500 mL.
2. Si el tampón se valora a pH 7,40 a 25 °C y se usa a 37 °C, ¿qué pH tendrá realmente y qué consecuencias tiene? Indica cómo corregirlo.
Read the worked answer
La relación ácido/base queda fijada, pero el pKa cambia con la temperatura:
ΔpKa = −0,031 × 12 = −0,372 → pKa(37 °C) = 8,06 − 0,372 = 7,688
pH(37 °C) = 7,688 + log(0,219) = 7,688 − 0,660 = 7,03
Es un error de 0,37 unidades, enorme para un enzima cuyo óptimo está en 7,40: la actividad puede caer a una fracción pequeña de la máxima y el ensayo no será reproducible entre días.
Corrección: valorar el tampón a 37 °C (baño termostatizado y electrodo compensado), no a temperatura ambiente. Si se prepara en frío, hay que recalcular la relación:
log r = 7,40 − 7,688 = −0,288 → r = 0,515 n(Tris) = 0,0100 × 0,515/1,515 = 3,40·10⁻³ mol → 0,412 g n(Tris·HCl) = 6,60·10⁻³ mol → 1,04 g
3. Demuestra con cálculos por qué no puede usarse el tampón fosfato en presencia de 1,0 mM de CaCl2.
Read the worked answer
A pH 7,40 y pKa2 = 7,20, la fracción de base conjugada es:
r = 10^(7,40−7,20) = 1,58 → [HPO4²⁻] = 0,020 × 1,58/2,58 = 0,0123 M
Concentración de fosfato terciario:
[PO4³⁻] = Ka3·[HPO4²⁻]/[H⁺] = (4,2·10⁻¹³ × 0,0123) / 3,98·10⁻⁸ = 1,3·10⁻⁷ M
Producto iónico frente al Ca3(PO4)2:
Q = [Ca²⁺]³[PO4³⁻]² = (1,0·10⁻³)³ × (1,3·10⁻⁷)² = 1,7·10⁻²³
Q ≫ Kps = 2,0·10⁻³³, y además por diez órdenes de magnitud: el fosfato cálcico precipita. El calcio libre caería muy por debajo de 1,0 mM y el enzima perdería su cofactor; además el precipitado enturbia las medidas espectrofotométricas.
Conclusión: hay que descartar el fosfato y usar Tris, que no compleja el calcio de forma apreciable (o HEPES si se necesita un pKa más próximo a 7,4 a 37 °C).
4. Sin cálculos adicionales, ¿qué otra precaución de diseño del tampón Tris deberías señalar en el informe?
Read the worked answer
Tres puntos de juicio práctico:
- Tampoco el Tris es ideal por su pKa: a 37 °C vale 7,69, es decir, se trabaja a 0,29 unidades por debajo del pKa, donde la capacidad tamponante es aún aceptable (≈ 0,44 del máximo) pero no óptima. Si el ensayo es crítico, HEPES (pKa ≈ 7,5 y ΔpKa/ΔT pequeño) es mejor elección.
- El Tris es una amina primaria y puede reaccionar con reactivos electrófilos (ésteres activos, aldehídos, algunos sustratos) y quelar metales de transición débilmente; conviene comprobar que no interfiere con el ensayo.
- No guardar valorado en nevera: además del cambio de pKa, la solubilidad del CO2 atmosférico acidifica el tampón con el tiempo; debe filtrarse, guardarse cerrado y verificarse el pH a la temperatura de uso el mismo día.