Preparación y verificación de un tampón fosfato para ensayo enzimático
Un laboratorio de bioquímica prepara 500,0 mL de tampón fosfato 0,100 M total (suma de H2PO4− y HPO4^2−) para un ensayo enzimático a pH 7,40 y 25 °C. Dispone de NaH2PO4(s) y Na2HPO4(s) anhidros, de pureza 98,0 % en masa, y de HCl 1,00 M. La constante pKa2 del ácido fosfórico es 7,20. El responsable rechaza ajustar el pH con NaOH concentrado porque alteraría la fuerza iónica y la concentración total de fosfato; exige calcular primero las masas de ambas sales. Después se añaden 5,00 mL de HCl 1,00 M a una alícuota de 500,0 mL del tampón, sin variar el volumen de forma apreciable. Se sabe que el pHmetro está calibrado y que la temperatura se mantiene. Hay que decidir si el tampón sigue siendo aceptable para el ensayo, cuyo criterio es pH entre 7,30 y 7,50.
1. Calcule la relación de concentraciones y las masas de NaH2PO4 y Na2HPO4 anhidros, teniendo en cuenta la pureza, necesarias para preparar el tampón.
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Con la ecuación de Henderson-Hasselbalch: pH = pKa + log([HPO4^2−]/[H2PO4−]); 7,40 = 7,20 + log r, luego r = 10^0,20 = 1,585.
Sea a = [H2PO4−]; entonces [HPO4^2−] = 1,585a y a + 1,585a = 0,100 M, de donde a = 0,0387 M y la base conjugada vale 0,0613 M. En 0,500 L: n(ácido) = 0,01935 mol y n(base) = 0,03065 mol.
Masas teóricas: 0,01935·119,98 = 2,32 g de NaH2PO4; 0,03065·141,96 = 4,35 g de Na2HPO4. Con pureza del 98,0 %: 2,32/0,980 = 2,37 g y 4,35/0,980 = 4,44 g.
2. Calcule el pH después de añadir 5,00 mL de HCl 1,00 M y decida si el tampón cumple el criterio del ensayo.
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5,00 mL de HCl 1,00 M aportan 5,00×10−3 mol de H+. El H+ convierte HPO4^2− en H2PO4−: nuevo n(base) = 0,03065 − 0,00500 = 0,02565 mol; nuevo n(ácido) = 0,01935 + 0,00500 = 0,02435 mol.
La relación es 0,02565/0,02435 = 1,053. pH = 7,20 + log(1,053) = 7,22. El volumen aumenta a 505 mL, pero la relación de moles no cambia; las concentraciones absolutas bajan alrededor de un 1 %. Como 7,22 < 7,30, el tampón ya no cumple el criterio y no debe usarse tal como está.
3. Explique por qué no se aconseja ajustar este tampón con NaOH concentrado a ciegas y qué implica para la capacidad tamponante.
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NaOH añadido convertiría H2PO4− en HPO4^2−, pero además introduciría Na+ y podría modificar la fuerza iónica; si se usa NaOH concentrado y no se recalcula, se corre el riesgo de sobrepasar el pH y de cambiar la composición total. En este caso el HCl ya ha desplazado el tampón fuera de la ventana, así que habría que preparar de nuevo o añadir una cantidad calculada de base y verificar el pH, no hacerlo a ciegas.
La capacidad tamponante máxima está cerca de pH = pKa = 7,20, donde las concentraciones de ácido y base conjugada son iguales. A pH 7,40 todavía es razonable, pero el margen frente a ácido es menor que frente a base.